Detekce nukleových kyselin pomocí metody dot-blot

Dot-blot patří mezi jednoduché, ale důležité biologické metody, které se běžně uplatňují ve výzkumných laboratořích a především v diagnostice. Jedná se o zjednodušený northern blot, nebo Southern blot, což jsou metody, které kombinují elektroforetickou separaci a imunodetekci^1,2. Při dot-blotu nemusí být prováděna gelová elektroforéza, což značí velkou časovou úsporu a hlavní výhodou této metody je možnost užití poměrně malého množství biologického vzorku. Pro detekci se využívá specifických vazeb antigen-protilátka. Nejčastěji se používá pro identifikaci a imunodetekci především proteinů, které mohou být markery nejrůznějších onemocnění³, nicméně tuto metodu lze využít i pro studium nukleových kyselin. Protilátky proti DNA byly poprvé objeveny roku 1957⁴ a jedná se o podskupinu antinukleárních protilátek, které se váží na jednořetězcovou anebo dvouřetězcovou DNA. Zpravidla jsou to IgM nebo IgG protilátky^5-7. Hlavním cílem experimentu bylo vyvinout jednoduchou, časově a finančně nenáročnou metodu specifické detekce nukleových kyselin, především DNA, a následně tento postup aplikovat na detekci DNA ovlivněné platinovými cytostatickými léčivy. Cytostatika na bázi platiny jsou již desetiletí úspěšně aplikována při chemoterapiích různých typů rakoviny, ale i přesto není zcela znám jejich biochemický účinek. Dnes obecně uznávaným názorem je, že tato léčiva tvoří adukty s buněčnou DNA a následně tak narušují transkripci a replikaci DNA^8,9.

Obr. 1 Koncentrační řada DNA

Tab. 1 Přepočet koncentrace na hmotnost DNA ve 2 µl vzorku

Graf 1 Závislost intenzity zabarvení spotu na množství DNA (inset – lineární úsek křivky)

Obr. 2 Intenzita zabarvení blotovací membrány v závislosti na délce blokování a použitém blokovacím roztoku

Obr. 3 Dot-blot platinových aduktů DNA

Graf 2 Závislost intenzity zabarvení spotu na množství a druhu aplikovaného cytostatického léčiva

1. Scitable by nature education; Northern blot; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.nature.com/scitable/definition/northern-blot-287.
2. Scitable by nature education; Southern blot; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.nature.com/scitable/definition/southern-blot-289.
3. Dot Blot Analysis; Teacher's Guidebook; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.gbiosciences.com/PDF/Protocol/502_Dot_Blot_Analysis_TEACHER.pdf.
4. Ceppellini R., Polli E., Celada F.: Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 96, 572 (1957).
5. Rothfiel.Nf, Stollar B. D.: Journal of Clinical Investigation, 46, 1785 (1967).
6. Schur P. H., Sandson J.: New England Journal of Medicine, 278, 533 (1968).
7. Tojo T., Friou G. J.: Science, 161, 904 (1968).
8. Fuertes M. A., Castilla J., Alonso C., Perez J. M.: Curr. Med. Chem., 10, 257 (2003).
9. Wang D., Lippard S. J.: Nat. Rev. Drug Discov., 4, 307 (2005).
10. Krizkova S., Adam V., Eckschlager T., Kizek R.: Electrophoresis, 30, 3726 (2009).

PDF